L’articolo di Nature del 2015 sugli esperimenti cinesi raccontati nella puntata di Leonardo sul coronavirus

Di
Redazione
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Una ricerca ufficiale condotta da un’equipe di ricercatori e pubblicata da Nature nel 2015, indicava i potenziali rischi patogeni derivanti dagli studi in laboratorio effettuati in Cina sui ceppi di coronavirus. In particolare, i ricercatori ritenevano troppo rischioso condurre studi sulla costruzione di virus chimerici basati sulla circolazione di ceppi in quanto troppo pericolosi per gli esseri umani. Sottolineando, inoltre, che gli studi di prevenzione devono essere soppesati dal rischio di creare agenti patogeni più pericolosi.

Ecco il testo integrale della ricerca tradotto in Italiano ↓

Un gruppo di coronavirus di pipistrello, simile alla SARS, mostra potenziali segnali di emergenza per la specie umana

L’emergenza di una grave sindrome respiratoria acuta di coronavirus (SARS-CoV) e la sindrome respiratoria medio-orientale (MERS) -CoV sottolineano la minaccia di trasmissione per l’uomo da parte delle specie incrociate. In questa sede abbiamo esaminato il potenziale patologico di un virus simile alla SARS, ovvero l’SHC014-CoV, che attualmente circola a causa di una specie particolare di pipistrello (c.d. muso a ferro di cavallo). Utilizzando il sistema di genetica inversa SARS-CoV2, abbiamo quindi generato e caratterizzato un virus chimerico che esprime una proteina ‘spike’ del coronavirus pipistrello SHC014, in un virus SARS-CoV a spina dorsale adattato a un topo. I risultati indicano che i virus del gruppo 2b che codificano il la proteina ‘spike’ SHC014 a spina dorsale di tipo selvaggio possono utilizzare in modo efficiente più ortologhi del recettore SARS nell’angiotensina umana che converte l’enzima II (ACE2), in grado replicarsi efficacemente nelle cellule primarie delle vie respiratorie umane e ottenere titoli in vitro equivalenti all’epidemia dei ceppi di SARS-CoV. Inoltre, esperimenti in vivo dimostrano la replicazione del virus chimerico nel polmone di topo con notevole patogenesi. La valutazione delle modalità immunoterapiche e profilattiche basate sulla SARS ha rivelato scarsa efficacia; entrambi gli approcci con anticorpi monoclonali e vaccini non sono riusciti a neutralizzare e proteggere dalle infezioni con CoV usando la nuova proteina. Sulla base di questi risultati, abbiamo sinteticamente ri-derivato un virus ricombinante SHC014 a lunghezza intera infettiva e dimostriamo una solida replicazione virale sia in vitro che in vivo. Il nostro lavoro suggerisce un potenziale rischio di riemersione di SARS-CoV da virus attualmente già diffuso nelle popolazioni di pipistrello.

Introduzione

L’emergere di SARS-CoV ha inaugurato una nuova era nella trasmissioni di gravi malattie respiratorie da parte delle specie incrociate, con conseguenze di rapide diffusioni globalizzate nel mondo e forte impatto sull’economia. Diversi ceppi, compresi i ceppi di influenza A H5N1, H1N1 e H7N9 e MERS-CoV — infatti sono emersi da popolazioni animali, causando notevoli malattie, mortalità e difficoltà economiche per le regioni colpite. Sebbene le misure adottate dalla sanità pubblica siano state in grado di fermare l’epidemia di SARS-CoV4, recenti studi di metagenomica hanno identificato sequenze di virus simili alla SARS, strettamente correlate a una razza di pipistrelli cinesi che circolano nella popolazione e che potrebbero rappresentare una minaccia futura. Tuttavia, i dati della sequenza da soli forniscono informazioni minime per identificare il virus e prepararsi per future pandemie. Pertanto, per esaminare l’emergenza potenziale (cioè il potenziale di infettare l’uomo) del pipistrello circolante CoV, abbiamo costruito un virus chimerico che codifica una nuova proteina zoologica di CoV — dalla sequenza RsSHC014-CoV da cui è stato isolato il ‘pipistrello con muso a ferro di cavallo’ cinese – nel contesto della spina dorsale ‘spike’ di SARS-CoV. Il virus ibrido ci ha permesso di valutare l’abilità della nuova proteina ‘spike’ di causare malattie indipendentemente dalle altre mutazioni adattative necessarie nella sua spina dorsale naturale. Usando questo approccio, abbiamo caratterizzato l’infezione da CoV mediata dall’SHC014 in cellule primarie delle vie aeree umane in vivo e testato l’efficacia delle terapie immunitarie disponibili contro SHC014-CoV. La strategia traduce i dati metagenomici per aiutare a prevedere e prepararsi per futuri virus emergenti.

La ricerca

Le sequenze di SHC014 e il relativo RsWIV1-CoV dimostrano come questi CoV sono i parenti più vicini ai ceppi epidemici di SARS-CoV (Fig. 1a, b); tuttavia, ci sono differenze importanti nei 14 residui che legano l’ACE2 umano, il recettore per SARS-CoV, tra cui i cinque che sono fondamentali per l’intervallo della ‘cellula ospite’: Y442, L472, N479, T487 e Y491 (rif. 7). Nel WIV1, tre di questi residui differiscono dall’epidemia Varietà SARS-CoV Urbani, ma non ci si aspettava che alterassero il legame secondo ACE2 (fig. 1a, be la tabella complementare 1). Questo fatto è confermato da entrambi gli esperimenti di pseudotipizzazione che hanno misurato la capacità dei lentivirus codificati come proteine a punta​ WIV1 di entrare in cellule di espressione umana ACE2 (Figura 1 complementare) e in vitro saggi di replicazione di WIV1-CoV (rif. 1). Al contrario, 7 su 14 ACE2- dei residui di interazione in SHC014 sono diversi da quelli in SARS-CoV, compresi i cinque residui critici per l’intervallo della ‘cellula ospite’ (Supplementare Fig. 1c e Tabella supplementare 1). Questi cambiamenti, associati al fallimento dei lentivirus pseudotipati che esprimono SHC014 spike per entrare nelle celle (Figura 1d supplementare), hanno suggerito che SHC014 spike non è in grado di legare l’ACE2 umano. Tuttavia, cambiamenti simili in ceppi SARS-CoV correlati erano stati segnalati per consentire l’associazione ACE27,8, suggerendo che erano necessari ulteriori test funzionali di verifica. Pertanto, abbiamo sintetizzato SHC014 spike nel contesto della spina dorsale SARS-CoV adattata (di seguito chiameremo il chimerico CoV come SHC014-MA15) per massimizzare le opportunità di patogenesi e gli studi sui vaccini nel 2006 sui topi (Figura 2a supplementare). Nonostante le previsioni di entrambi i modelli basati sulla struttura e gli esperimenti di pseudotipizzazione, SHC014-MA15 era praticabile e replicato ad alti titoli nelle cellule in vero (Supplementare Fig. 2b). Analogamente alla SARS, SHC014-MA15 richiedeva anche una molecola ACE2 funzionale per l’ingresso e per questo poteva usare ortologhi ACE2 umani, di zibetti e pipistrelli (Figura 2c, d supplementare). Per testare la capacità di SHC014 di mediare l’infezione per vie respiratorie umane, abbiamo esaminato la sensibilità all’infezione della linea cellulare epiteliale umana per vie respiratorie Calu-3 2B4 (rif. 9) e abbiamo riscontrato una robusta replicazione SHC014-MA15, paragonabile a quella di SARS-CoV Urbani (Fig. 1c). Per estendere questi risultati, sono state infettate delle colture epiteliali primarie delle vie aeree umane (HAE) e hanno mostrato una solida replicazione di entrambi i virus (Fig. 1d). Insieme, i dati confermano la capacità dei virus SHC014 spike di infettare le cellule umane per vie aerea e sottolineano la potenziale minaccia di trasmissione tra specie di SHC014-CoV.

Il test sui topi

Per valutare il ruolo di SCHO14 nel mediare l’infezione in vivo,  abbiamo infettato dei topi BALB/c di 10 settimane di vita con 10⁴ unità di placca (p.f.u.) di SARS-MA15 o SHC014-MA15 (Fig. 1e-h). Gli animali infetti da SARS-MA15 hanno subito una rapida perdita di peso ed è stato registrato un alto livello di letalità 4 giorni dopo l’infezione (d.p.i.); l’infezione da SHC014-MA15, invece, ha prodotto una notevole perdita di peso (10%) ma nessuna letalità nei topi (Fig. 1e). L’esame della replicazione virale ha prodotto risultati quasi equivalenti dall’analisi dei polmoni dei topi infetti da SARS-MA15 e SHC014-MA15 (Fig. 1f). Mentre i polmoni dei topi con infezione da SARS-MA15 hanno mostrato una colorazione robusta in entrambi i bronchioli terminali e nel parenchima polmonare 2 d.p.i. (Fig. 1g), quelli dei topi con infezione da SHC014-MA15 hanno mostrato una colorazione ridotta dell’antigene delle vie aeree (Fig. 1h); al contrario, nessun deficit di colorazione dell’antigene è stata osservata nel parenchima o nell’istologia generale, suggerendo un’infezione differente del tessuto polmonare per SHC014- MA15 (tabella supplementare 2). Successivamente abbiamo analizzato l’infezione in animali più suscettibili ai virus, anziani (di 12 mesi). Per quanto riguarda SARS-MA15- gli animali infetti hanno perso rapidamente peso e hanno ceduto all’infezione (Figura 3a, b supplementare). Per quanto riguarda l’infezione indotta da SHC014-MA15 si è registrata una perdita di peso robusta, ma una mortalità minima. Le tendenze nell’istologia e i modelli di colorazione dell’antigene che abbiamo osservato nei giovani i topi sono stati conservati negli animali più anziani (tabella supplementare 3). Abbiamo escluso la possibilità che SHC014-MA15 stesse mediando l’infezione attraverso un recettore alternativo sulla base di esperimenti su topi Ace2 – / -, che non hanno mostrato perdita di peso o colorazione dell’antigene dopo l’infezione da SHC014-MA15 (Fig. 4a supplementare, be Tabella supplementare 2). Insieme, i dati indicano che i virus SHC014 spike sono in grado di indurre la perdita di peso nei topi nel contesto di una spina dorsale virale CoV. Data l’efficacia preclinica dell’anticorpo monoclonale di Ebola terapie, come ZMApp10, successivamente, abbiamo cercato di determinare l’efficacia degli anticorpi monoclonali SARS-CoV contro l ‘infezione da SHC014-MA15. 

L’efficacia degli anticorpi

Quattro targeting per anticorpi monoclonali umani ampiamente neutralizzanti la proteina di picco SARS-CoV erano stati precedentemente riportati e sono identificabili come probabili reagenti per l’immunoterapia. Abbiamo esaminato l’effetto di questi anticorpi sulla replicazione virale (espressi come percentuale di inibizione della replicazione) e hanno scoperto che mentre la SARS-CoV (allele selvatico) Urbani è stato fortemente neutralizzato da tutti e quattro gli anticorpi relativamente a bassa concentrazione di anticorpi (Fig. 2a-d), si è manifestata una neutralizzazione diversa per SHC014-MA15. Fm6, un anticorpo generato dal display dei fagi e mutanti di fuga, ha raggiunto solo livelli di inibizione di fondo della replicazione SHC014-MA15 (Fig. 2a). Allo stesso modo, anticorpi 230.15 e 227.14, che sono stati derivati ​​dalle cellule di memoria B di SARS-CoV– di pazienti infetti, inoltre, non sono riusciti a bloccare la replicazione SHC014-MA15 (Fig. 2b, c). Per tutti e tre gli anticorpi, differenze tra la SARS e le sequenze di amminoacidi con spike SHC014 corrispondevano a dirette o a cambiamenti adiacenti residuali, rilevati nei mutanti di fuga SARS-CoV (fm6 N479R; 230.15 L443V; 227.14 K390Q / E). Questo probabilmente spiega l’assenza dell’attività neutralizzante degli anticorpi contro SHC014. Infine, l’anticorpo monoclonale 109,8 è stato in grado di ottenere una neutralizzazione del 50% di SHC014-MA15, ma solo ad alte concentrazioni (10 µg / ml) (Fig. 2d). Insieme, i risultati dimostrano ampiamente che gli anticorpi contro SARS-CoV possono avere solo un’efficacia marginale nei confronti di ceppi emergenti di tipo CoS simili alla SARS come SHC014.

I vaccini esistono? Sono efficaci?

Per valutare l’efficacia dei vaccini esistenti contro l’infezione con SHC014-MA15, abbiamo vaccinato topi anziani con doppia-inattivazione per intero di SARS-CoV (DIV). Lavori precedenti hanno dimostrato che DIV potrebbe neutralizzare e proteggere i giovani topi dalle sfide con un virus omologhi; tuttavia, il vaccino non è riuscito a proteggere gli animali in età avanzata, anzi, è stato anche osservato un aumento dell’immunità patologica, indicando la possibilità che gli animali vengano danneggiati a causa della vaccinazione. Qui abbiamo scoperto che DIV non ha fornito protezione dalle sfide con SHC014-MA15 per quanto riguarda la perdita di peso o il titolo virale (Figura 5a, b supplementare). Coerente con un precedente rapporto con altro gruppo eterologo 2b CoVs15, siero di vaccino contro DIV, anche i topi anziani non sono riusciti a neutralizzare SHC014-MA15 (Supplementare Fig. 5c). In particolare, la vaccinazione con DIV ha prodotto una solida patologia immunitaria (tabella supplementare 4) ed eosinofilia (supplementare Fig. 5d – f). Insieme, questi risultati confermano che il vaccino DIV sembrerebbe non essere protettivo contro l’infezione da SHC014 e potrebbe aumentare la malattia nel gruppo vaccinato invecchiato. Contrariamente alla vaccinazione dei topi con DIV, l’uso di SHC014-MA15 come vaccino in vivo ha mostrato una potenziale protezione incrociata contro SARS-CoV, ma i risultati hanno mostrato importanti preoccupazioni. Abbiamo infettato i topi giovani con 10⁴ p.f.u. di SHC014-MA15 e li abbiamo osservati per 28 giorni. Al 29° giorno abbiamo quindi messo alla prova i topi con SARSMA15 (Figura 6a supplementare). La precedente infezione di i topi con la dose elevata di SHC014-MA15 aveva conferito una protezione contro una dose letale di SARS-MA15, sebbene lì ci fosse solo una minima risposta di neutralizzazione SARS-CoV da parte degli antisieri utilizzati 28 giorni dopo l’infezione da SHC014-MA15 (Supplementare Fig. 6b, 1: 200). In assenza di un aumento dell’antigene secondario, 28 d.p.i. rappresenta il picco atteso dei titoli anticorpali e implica che ci sarà una diminuzione della protezione contro SARS-CoV nel tempo. Risultati simili, che mostrano protezione contro una dose letale di SARS-CoV, sono stati osservati in topi BALB / c anziani con riferimento a perdita di peso e replicazione virale (Figura 6c, d supplementare). Tuttavia, la dose di infezione SHC014-MA15 di 104 p.f.u. conduce a un aumento del 10% della perdita di peso e della letalità in alcuni animali anziani (Fig. 1 e Supplementari Fig. 3). Abbiamo scoperto che la vaccinazione con una dose inferiore di SHC014-MA15 (100 p.f.u.), non induce a perdita di peso, ma anche che non è riuscito a proteggere gli anziani animali da una dose letale SARS-MA15 (Supplemento Fig. 6e, f). Nel complesso, i dati suggeriscono che l’utilizzo di SHC014-MA15 può conferire protezione incrociata contro SARS-CoV mediante conservazione epitopi, ma la dose richiesta induce patogenesi e preclude la possibilità di utilizzi come vaccino.

Le conclusioni

Avendo stabilito che SHC014 spike ha la capacità di mediare l’infezione delle cellule umane e causare la malattia nei topi, abbiamo poi sintetizzato un clone infettivo SHC014-CoV a lunghezza intera basato sullo stesso approccio usato per SARS-CoV (Fig. 3a) 2. La replica nelle cellule in Vero non ha rivelato deficit per SHC014-CoV rispetto a quello per SARS-CoV (Fig. 3b); tuttavia, SHC014-CoV è stato significativamente (P <0,01) attenuato nelle culture primarie di HAE a 24 e 48 ore dopo l’infezione (Fig. 3c). L’infezione in vivo dei topi non ha comportato una significativa perdita di peso, ma ha mostrato una replicazione virale ridotta dell’infezione SHC014-CoV nei polmoni a piena lunghezza, rispetto alla SARS-CoV Urbani (Fig. 3d, e). Insieme, i risultati stabiliscono la variabilità dell’intera lunghezza di SCH014-CoV, ma suggeriscono che saranno necessari futuri adattamenti per quanto riguarda la sua replicazione per poter essere equiparati alla pandemia provocata da SARS-CoV nelle cellule respiratorie umane e animali (topi).

Durante l’epidemia di SARS-CoV, furono rapidamente stabiliti dei collegamenti tra zibetti e ceppi di CoV che erano stati rilevati negli umani. Sulla base di questa scoperta, il paradigma di emergenza comune sostiene che l’epidemia di SARS-CoV ha avuto origine da virus di pipistrello, balzato poi a zibetti e che i cambiamenti siano stati incorporati nel dominio vincolante del recettore (RBD) per migliorare il legame con lo zibetto Ace2 (rif. 18). La successiva esposizione alle persone nei mercati di animali vivi ha permesso l’infezione umana con il ceppo di zibetto, che, a sua volta, si è adattato per diventare il ceppo epidemico (Fig. 4a). Tuttavia, l’analisi filogenetica suggerisce che i primi ceppi umani di SARS sembrano più strettamente correlati ai ceppi di pipistrello che allo zibetto strains18. Pertanto, un secondo paradigma sostiene che la trasmissione diretta pipistrello-umano ha iniziato l’emergenza SARS-CoV e quella zibetta sia servita da ospite secondario e serbatoio per l’infezione continua (Fig. 4b) 19. Per entrambi i paradigmi, adattarsi al picco mediante un ospite secondario è visto come una necessità, con la maggior parte delle mutazioni previste all’interno l’RBD, facilitando così il progresso dell’infezione. Entrambe le teorie implicano che le riserve di COV nei pipistrelli sono limitate e che le mutazioni del range-ospite sono casuali e rare, riducendo la probabilità di emergenze future eventi nell’uomo. 

Sebbene il nostro studio non invalidi le altre strade, apre le porte alla discussione di un terzo paradigma in cui le riserve CoV di pipistrello circolanti mantengono le proteine ​​in bilico e fa sì che queste ultime siano in grado di infettare gli esseri umani senza bisogno di mutazione o adattamento (Fig. 4c). Questa ipotesi è illustrata dalla capacità di un virus chimerico contenente l’SHC014 spike di una spina dorsale SARS-CoV di causare una infezione robusta nelle vie aeree umane e nei topi senza adattamento RBD. Accoppiato con l’osservazione di elementi di spina dorsale CoV patogeni precedentemente identificati, i nostri risultati suggeriscono che i materiali di partenza richiesti per i ceppi emergenti simili alla SARS circolano attualmente negli animali serbatoi. In particolare, anche se probabilmente l’SHC014-CoV integrale richiede un ulteriore adattamento della spina dorsale per mediare la malattia umana, gli eventi di ricombinazione ad alta frequenza nelle famiglie CoV documentati sottolineano la possibilità di emergenze in futuro e la necessità di ulteriore preparazione.

Ad oggi, gli schermi di genomica delle popolazioni animali sono stati principalmente utilizzati per identificare nuovi virus nelle impostazioni delle epidemie. L’approccio utilizzato in questa sede estende questi set di dati per esaminare le questioni virali emergenza ed efficacia terapeutica. Consideriamo i virus di SHC014 spike una potenziale minaccia a causa della loro capacità di replicarsi nelle vie respiratorie umane, rappresentando il miglior modello per predisporre malattie umane. Inoltre, la patogenesi osservata nei topi indica la capacità dei virus contenenti SHC014 di causare malattie nei mammiferi, senza adattamento RBD. In particolare, tropismo differenziale nel polmone rispetto a quello con SARS-MA15 e attenuazione di SHC014-CoV integrale nelle colture HAE rispetto a SARS-CoV Urbani suggerisce che i fattori oltre il legame ACE2 possono contribuire all’emergenza. Tuttavia, per tradurre questi risultati in potenziali elementi patogeni per gli umani sono necessari ulteriori test su primati non umani. È importante sottolineare che il fallimento delle terapie disponibili definiscono un bisogno fondamentale per ulteriori studi e per lo sviluppo di trattamenti. Con questa background, programmi di sorveglianza, reagenti diagnostici e trattamenti efficaci possono essere prodotti, in modo tale che possano essere protettivi contro l’emergere del gruppo CoV specifici di 2b, come SHC014, e possono essere applicati ad altre branche CoV che mantengono le riserve altrettanto eterogenee.

Suggerimenti

Oltre ad offrire preparazione contro i futuri emergenti virus, questo approccio deve essere considerato nel contesto di pausa obbligatoria del governo degli Stati Uniti sul ‘guadagno in funzione degli studi’ (GOF). Sulla base di precedenti modelli di emergenza (Fig. 4a, b), la creazione di virus chimerici come SHC014-MA15 non ci si aspettava che avrebbe aumentato la patogenicità. Anche se SHC014-MA15 è attenuato rispetto al ‘parente’ SARS-CoV adattato dal topo, studi simili che esaminano la patogenicità dei CoV con il tipo selvaggio il picco di Urbani all’interno della spina dorsale MA15, non hanno mostrato perdita di peso nei topi e una ridotta replicazione virale. Pertanto, rispetto ai picchi di Urbani– MA15 CoV, SHC014-MA15 evidenza un aumento della patogenesi (Fig. 1). Sulla base di questi risultati, i gruppi di esperti scientifici possono ritiene studi simili sulla costruzione di virus chimerici basati sulla circolazione dei ceppi troppo rischiosi da perseguire, in quanto i mammiferi non posso essere esclusi dalla patogenicità di tali modelli. Accoppiato con restrizioni sui ceppi adattati e sullo sviluppo di anticorpi monoclonali che utilizzano i mutanti di fuga, la ricerca sull’emergenza di CoV e l’efficacia terapeutica possono essere gravemente limitate andando avanti. Questi dati e le restrizioni rappresentano un crocevia di preoccupazioni per la ricerca del GOF; il potenziale per prepararsi e mitigare i futuri focolai deve essere soppesato dal rischio di creare agenti patogeni più pericolosi.
Nello sviluppo delle politiche per il futuro, è importante considerare il valore dei dati generati da questi studi e se questi tipi di studi sul virus chimerico giustificano ulteriori indagini rispetto i rischi inerenti.

Nel complesso, il nostro approccio ha utilizzato i dati metagenomici per identificare a potenziale minaccia rappresentata dal pipistrello circolante CoS SHC014 simile alla SARS. A causa della capacità dei virus chimerici SHC014 di replicarsi le nelle vie respiratorie umane, sono in grado di causare elementi patogeni in vivo e sfuggono alle attuali terapie, c’è bisogno sia di sorveglianza che di miglioramento nelle terapie contro i virus circolanti simili alla SARS. Il nostro approccio sblocca anche l’uso dei dati metagenomici per prevedere l’emergenza virale e applicare questa conoscenza per prepararsi a trattare future infezioni provocate dal virus. 

Il testo originale della ricerca – (INGLESE)

A SARS-like cluster of circulating bat coronaviruses show potential for human emergenceDownload

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